海星生物助力结肠癌靶向治疗研究--作者通过海星生物提供物料构建了HCT细胞RINCK基因敲除株进行一系列实验，发现RINCK敲除能够促进泛素-蛋白酶体降解，使NRF2转录信号失活，显著延缓结肠癌细胞的增殖和肿瘤的生长，为下一步靶向治疗提供了参考。该文章发表在Phytomedicine，影响因子为7.9，题目为OchratoxinApromoteschronicenteritisandearlycolorectalcancerprogressionbytargetingRincksignaling。
前沿简介炎症性肠病（InflammatoryBowelDisease，IBD）是一种慢性、终身、复发性的胃肠道疾病，影响着全球万人，大约50%的风险可能发展为结肠炎相关癌症。结肠炎及其相关肿瘤发生的发病机制尚未完全清楚，因此迫切需要确定介导慢性炎症反应的关键靶点，以抑制结肠炎及其相关疾病的发生和发展。
霉菌毒素，如黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A(OTA)，在许多主食中发现有可测量的水平，人们对长期接触这些毒素的健康影响知之甚少。越来越多的证据已经证实OTA在上调氧化应激和炎症反应诱导的组织损伤中的重要作用。但赭曲霉毒素A是否能促进慢性结肠炎及其相关结肠癌（CRC）的发生发展，其分子机制尚不清楚。此外，RING指与C激酶相互作用蛋白（RINCK）是一种泛素连接酶，介导免疫应答，RINCK在结肠炎调节中的潜在分子功能仍然很大程度上未知。研究结果1.口服亚慢性OTA治疗促进啮齿动物模型中DSS触发的结肠炎病理表型
由于OTA与结肠炎进展可能正相关，我们首先分析口服亚慢性OTA预暴露是否加速DSS诱导的结肠炎病理表型。对小鼠进行4周OTA或媒介物（NaHCO3）处理，随后10周DSS或者生理盐水处的WTC57BL/6小鼠。如图1所示记录其体重、内脏脂肪、肝损伤情况，肠组织HE染色，ZO-1andoccludin1表达水平，这些结果揭示了具有OTA预暴露的DSS诱导的小鼠显著地加重了代谢失调、炎症和氧化应激，导致小鼠的慢性结肠炎进展。
图1口服亚慢性OTA暴露加速啮齿动物模型中DSS触发的结肠炎病理表型2.在人类患者和啮齿动物模型中，RINCK表达与IBD和CRC严重程度正相关为了研究RINCK在炎症性肠病中的参与，我们检测了其在从小鼠结肠炎模型和具有UC、CD和CRC表型的人类患者获得的结肠组织中的水平。如图2所示，我们发现，响应于nMOTA+2.0%DSS（wt/vol）（OTA/DSS）或0.1mg/mlLPS处理的人FHC细胞、HCT细胞、小鼠CT26细胞和原代肠上皮细胞（IEC），以及OTA/DSS或AOM/OTA/DSS共处理的WT小鼠或UC、CD或CRC患者样品中的时程，泛素相关靶分析前1种可区分表达的泛素相关连接酶候选物即，RINCK标记在这些参与者组的交叉点，检测到E3泛素连接酶指示基因表达改变的所有基因，其中RINCK在整个分析中表现出明显的上调。图2RINCK表达在IBD和CRC表型患者以及小鼠结肠炎中上调为了深入研究和鉴定RINCK在结肠炎发病机制中的主要催化底物，接下来使用RNA-seq测定来分析24小时OTA/DSS后具有腺病毒介导的RINCK恢复（AdRINCK）的RINCK缺陷的人FHC细胞中的基因表达变化。如图3所示，在人类亚成体和啮齿动物模型中RINCK和NRF2共表达的质谱和免疫荧光分析的联合分析表明，NRF2是RINCK的伴侣蛋白和直接下游靶点。在OTA/DSS治疗方案下，RINCK在结肠炎进展过程中起着关键的保护作用。图3NRF2被鉴定为RINCK的靶蛋白和相互作用伴侣蛋白3.肠上皮细胞特异性Rinck基因敲除延缓OTA-DSS共触发结肠炎表型
为了进一步研究RINCK在结肠炎进展中的潜在作用，在OTA预施用4周后，通过DSS治疗在小鼠模型中建立结肠炎疾病。本研究构建了肠上皮细胞特异性Rinck基因敲除小鼠[IEC-Rinck（KO）]，并用于研究Rinck在结肠炎进展中的分子功能。如图4所示，我们发现OTA-DSS给药降低了Flox小鼠的体重，而在OTA-DSS处理的IEC-Rinck（KO）小鼠中显著减轻。OTA-DSS处理的IECRinck（KO）小鼠的疾病活动指数（DAI）评分、出血发生率和死亡率也低于Flox小鼠组。根据组织学病变，检测血清LPS水平和氧化应激相关指标，与相应对照组相比，OTADSS诱导的IECRinck（KO）小鼠结肠组织MPO和MDA含量降低，而血清白蛋白、组织HO-1、SOD含量以及相应的抗氧化应激相关因子Ho-1、Nqo-1、Nrf2、Gclc、Gclm、Sod1和Sod2mRNA表达谱改变升高。
图4肠上皮细胞特异性Rinck敲除减少了OTA-DSS共诱导小鼠的结肠炎进展如图5所示，OTA-DSS注射后，IEC-Rinck(KO)小鼠的血清和结肠中促炎细胞因子TNF-α，IL-6,IL-1β，IL-17A和CCL2的含量以及炎症基因表达谱的改变均显著低于对照组。结肠组织中F4/80、CD11b、CD68和p-NF-κB的阳性表达也明显降低。IEC-Rinck（KO）小鼠结肠组织中F4/80、CD11b、CD68和p-NF-κB阳性表达的组织学测定也降低。
图5肠上皮细胞特异性Rinck过表达促进OTA-DSS共诱导小鼠的结肠炎进展
我们进一步研究了上述样本中Nrf2轴信号通路的表达变化。在OTA-DSS攻击过程中，IECRinck（KO）小鼠的细胞质中Nrf2蛋白和p-NF-κB水平降低，同时伴有Nrf2核转位的增加，提示IECRinck（KO）可显著促进OTA-DSS攻击过程中Nrf2核转位和抗氧化应激因子的产生。表明Rinck的结肠功能丧失减弱了结肠炎症反应、氧化应激和组织损伤，导致体内结肠炎的减轻。这些数据显示，Rinck的结肠功能获得显著加速结肠炎症反应、氧化应激和组织损伤，导致体内结肠炎的进展。
4.肠上皮细胞特异性Rinck过表达促进OTA-DSS共触发结肠炎表型
考虑到Rinck表达与小鼠模型中结肠炎严重程度的正相关性，基于Rosa26条件性和/或诱导性转基因（以下称为IEC-Rinck（Rosa））。将Rinck（Rosa）小鼠与Villin-Cre小鼠杂交，以在IEC中特异性过表达Rinck，然后进行OTA-DSS攻击[IEC-Rinck（OE）。与IEC-Rinck（KO）小鼠相反，OTA-DSS施用降低了Flox小鼠的体重，而IEC-Rinck（OE）小鼠显著促进了OTA-DSS施用。值得注意的是，在体外试验中，腺病毒（Ad）介导的RINCK恢复（AdRINCK）在人RINCK缺陷的FHC细胞中也显示出Nrf2活性、抗氧化因子的降低，伴随着p-NF-κB蛋白水平和促炎细胞因子表达的增加。
5.Rinck通过调节Nrf2信号促进结肠炎进展
由于Rinck对结肠炎的进展及其阿索病理过程有副作用，因此我们不得不研究Rinck的分子机制及其内在功能。鉴于Nrf2作为Rinck的潜在靶标和底物的确定，我们接下来产生了IEC-Nrf2（KO）和IEC特异性Nrf2和Rinck双缺失小鼠[IEC-Rinck-Nrf2（DKO）。如预期的，Nrf2缺失阻断了Rinck敲除触发的结肠炎发病进展的缓解。我们进一步发现OTADSS治疗降低了IEC-Rinck-Nrf2（DKO）小鼠和IEC-Nrf2（KO）小鼠的体重，而在IECRinck（KO）小鼠中显著地挽救了体重。与IEC-Rinck（KO）组相比，IEC-Rinck-Nrf2（DKO）和IEC-Nrf2（KO）小鼠中Nrf2的显著降低和p-NF-κB的增加进一步支持了这一发现。这些结果表明，Nrf2是Rinck在结肠炎发展中的功能所必需的。图6Nrf2是Rinck对OTA-DSS联合治疗的结肠炎的保护功能所必需的6.Rinck通过直接与Nrf2相互作用促进结肠炎，从而促进其泛素化降解
为了深入研究Rinck是否以及如何促进结肠炎中氧化应激和炎症反应的潜在分子机制，采用免疫共沉淀法（Co-IP）分析RINCK的作用机制。实际上用Flag-NRF2和Myc-RINCK共转染人FHC细胞。如图7所示，在OTA-DSS共处理过程中，RINCK可能通过泛素-蛋白酶体途径促进NRF2的降解。图7RINCK直接相互作用并促进K48连接的NRF2泛素化降解7.抑制Rinck减轻啮齿动物和兔模型中OTA-DSS触发的急性结肠炎
鉴于急性和慢性期结肠炎进展的可能差异和发病机制，这迫使我们进一步探索抑制Rinck是否也可以保护免受OTA-DSS诱导的急性结肠炎表型。如图8所示，这些体内研究结果表明，通过基因治疗抑制Rinck在急性和慢性期均能减缓结肠炎的进展。
图8Rinck抑制基因对大鼠和兔炎症性肠病模型急性结肠炎的治疗作用8.RINCK缺陷减少小鼠结肠炎相关的致癌作用长时间的DSS激发也促进了结肠炎相关肿瘤的发生。为了探究RINCK表达变化是否参与了这一过程，我们首先通过生物信息学分析RINCK表达与临床人类结直肠癌(CRC)受试者的相关性。如图9所示，On转载请注明：http://www.kenteecseating.com/zcyzj/9632.html
